【知识库】ITC您所关心的问题，这里都有答案

关于 ITC 技术的问与答

1、N值是不是一般都是1左右？N值是一个很大的负值是否正常？

答：ITC中的N值表示化学计量比，它取决于分子相互作用自身的性质。1:1结合的相互作用一般较多，所以多数分子互作的N值都是1，关于这类结合的研究也比较透彻。但是，当蛋白上含有两个结合位点，或者蛋白由多个相同亚基组成时，N值可能更高。当N值远小于1，多数情况下反映出被滴定物的活性浓度（活性构象等）远低于100%。N值为负值不正常。

2、参比池放纯水、缓冲会对实验结果有不同影响吗？

答：在ITC实验中，对于水相体系的样品而言（如常见的生物缓冲体系或者含10%以下有机溶剂如DMSO的体系），参比池一般只放脱过气的纯水并定期更换，不放缓冲液。参比池的作用是作为温度的参照。做ITC的Control实验(如滴定剂滴buffer)则需要单独做一次滴定，这时参比池为水，样品池为buffer。

3、有没有软件可以模拟预实验，从而大致确定浓度？

答：PEAQ-ITC控制软件中可以进行多种模型的ITC实验模拟，如单套位点模型、两套位点模型等，其模拟过程需要用户输入一些参数如大致的亲和力范围、化学计量比，浓度，C值等，可以作为大家学习的工具。如果使用其他型号的仪器如ITC200，则在Origin拟合界面有一个simulation的按钮可以进行模拟。

4、DMSO是否会影响aptamer的识别能力？

答：DMSO作为助溶的有机溶剂在常用5-10%的浓度条件下一般不会影响分子间识别。但是，由于ITC测定是表观吸放热，我们需要确保滴定针和样品池中均含有浓度一致的DMSO从而消除背景热量。对于某些生物分子而言，一定浓度的DMSO有可能对分子构象和热稳定性造成影响，从而导致构象的局部展开和非特异性结合的发生。因此，需要对DMSO环境下的生物分子稳定性做一些分析，如通过DSC以及光散射技术等。

5、核酸和蛋白互作，哪个放cell中？

答：ITC是一种平衡实验，通过检测因分子间相互作用吸收或者放出的热量来计算相关的热力学参数。ITC没有分子量限制，样品放置的原则通常由互作分子的价态、可用量、稳定性等决定。一般多价态的分子放在样品池比较有利于分析，具有较高浓度且稳定的样品作为滴定针的物质。对于1:1反应而言，我们更建议大家在样品允许的情况下，既做正向滴定也做反向滴定（Reverse Titration）进行交互验证。

6、仪器能加热Decon-90吗？还是自己手动加热？

答：用14% (v/v)的Decon-90清洗液加热泡洗样品池是一种非常有效去除生物聚集体和沉淀物的方法。对于PEAQ-ITC的用户，选择Soak即可实现自动加热泡洗和纯水清洗；对于ITC 200和VP-ITC的用户，需要手动将Decon-90加入样品池并调整其温度至50-60℃，浸泡20分钟后执行Wash (long)操作进行样品池清洗。

7、能否根据KD值知道小分子与蛋白是弱结合，强结合，还是不结合？如果可以的话，具体的范围是多少呀？

答：这个问题的答案并不只有一个，通常根据经验来确定。一般来说，我们认为nM级别左右的亲和力属于强结合；μM级别左右的亲和力属于中等强度结合；mM级别左右的亲和力属于弱结合。各种强度亲和力之间的界限并不绝对，相互会有交叠。小分子与蛋白质结合力的亲和力范围非常广，有的亲和力较弱，在几百μM；有的亲和力较强，在pM。

8、蛋白和药物的浓度一般怎么选择？

答：蛋白和药物的浓度选择在ITC实验中一般要根据两种分子结合的大致亲和力KD来进行估算。若您手头有IC50，SPR（表面等离子体共振），GCI (光栅耦合干涉)等实验数据，您可以将它用作预估KD的参考，并基于C值来设计ITC实验。如果没有任何参考数据，建议首先尝试200 μM药物滴定20 μM蛋白的条件。

9、遇到始终滴不到饱和的样品应该怎么办？

答：ITC滴定曲线的形态取决于分子间互作的亲和力。对于具有中等偏弱亲和力的分子互作，我们会得到无法滴定到饱和的ITC结果。这很正常。对于滴定不到饱和的样品，您可以首先做滴定物滴buffer的Control实验以确认是否有背景放热；对于背景放热较小的滴定，提高滴定物与被滴定物的浓度比例通常可以更好的看到信号饱和的趋势；您也可以连续滴定2-3个ITC结果，比如：实验一、A滴B；实验二、A滴 实验一滴定完样品池中A/B混合样品，然后通过Concat软件（在Malvern Panalytical网站上下载）将两次ITC实验的滴定结果连接起来作为一个实验数据进行分析。在分析不饱和数据时，通常需要固定化学计量比N值，如1。（请根据分子结合的生物学背景进行N值的确认）

10、样品浓度，参数设置，还有哪些注意事项？

答：这几项内容在讲座中介绍的比较清楚，请参考视频中“如何做好一个ITC实验"部分。